Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richard Henderson han recibido el Premio Nobel de Química 2017 por haber desarrollado un método eficaz para generar imágenes tridimensionales de las biomoléculas. Usando microscopía crioelectrónica los investigadores pueden ahora congelar biomoléculas en pleno movimiento y fotografiarlas con resolución atómica. Esta tecnología ha llevado a la bioquímica a una nueva era.

El fuerte haz de electrones fue un problema importante, pero los investigadores aprovecharon la forma de empaquetarse las moléculas de bacteriorrodopsina en la membrana. En lugar de utilizar un haz estándar hicieron pasar un flujo más débil a través de la muestra. El contraste de la imagen era pobre y no podían ver las moléculas individuales, pero teniendo en cuenta que  las proteínas se empaquetaban y orientaban regularmente en la misma dirección, todas las proteínas difractan los haces de electrones de una manera casi idéntica, lo que permitió calcular una imagen más detallada basada en el patrón de difracción que utilizaba un enfoque matemático similar al utilizado en la cristalografía de rayos X.

En la siguiente etapa, los investigadores giraron la membrana bajo el microscopio electrónico, tomando imágenes desde diferentes ángulos. De esta manera (en 1975) fue posible producir un modelo tridimensional de la estructura de la bacteriorrodopsina, que mostraba cómo la cadena de proteína se movía a través de la membrana

Era la mejor imagen de una proteína generada utilizando un microscopio electrónico. Muchas personas quedaron impresionadas con la resolución, que fue de 7 Ångström (0.0000007 milímetros), pero esto no fue suficiente para Richard Henderson. Su objetivo era lograr la misma resolución que la proporcionada por la cristalografía de rayos X, de aproximadamente 3 Ångström, y estaba convencido de que el microscopio electrónico tenía más que ofrecer.

El primer modelo aproximado de bacteriorodopsina, publicado en 1975.

 Imagen de Nature 257: 2 8 -32

En 1990, Henderson presentó una estructura de bacteriorrodopsina con resolución atómica.

Richard Henderson fue agregando poco a poco más detalles al modelo de bacteriorrodopsina. Finalmente, en 1990, 15 años después de haber publicado el primer modelo, Henderson logró su objetivo y pudo presentar una estructura de bacteriorrodopsina con resolución atómica.

Demostró que la cryo-EM podría proporcionar imágenes tan detalladas como las generadas utilizando cristalografía de rayos X, lo cual fue un hito crucial. Sin embargo este progreso se basó en una excepción: que la proteína se empaqueta naturalmente de manera regular en la membrana. Pocas proteínas se ordenan espontáneamente de esta manera. La pregunta era si el método podría generalizarse:¿sería posible usar un microscopio electrónico para generar imágenes 3D de alta resolución de proteínas que se dispusieran al azar en la muestra orientándose en diferentes direcciones? Richard Henderson creía que sí, mientras otros pensaban que esto era una utopía.

Al otro lado del Atlántico, en el Departamento de Salud del Estado de Nueva York, Joachim Frank había trabajado durante mucho tiempo para encontrar una solución a ese problema.

En 1975, presentó una estrategia teórica donde la información, aparentemente mínima, encontrada en las imágenes bidimensionales del microscopio electrónico, podría fusionarse para generar un todo tridimensional de alta resolución.

La estrategia de Joachim Frank se basa en discriminar, mediante un programa informático, entre las proteínas colocadas al azar y el fondo borroso del microscopio electrónico. Desarrolló un método matemático que permitía al ordenador identificar diferentes patrones recurrentes en la imagen. Luego el ordenador clasifica patrones similares en el mismo grupo y fusiona la información para generar una imagen promedio más nítida. De esta manera obtuvo una serie de imágenes bidimensionales de alta resolución que mostraban la misma proteína pero desde diferentes ángulos. Los algoritmos del software se completaron en 1981.

El siguiente paso fue determinar matemáticamente cómo fusionar las diferentes imágenes bidimensionales entre sí y para obtener una imagen 3D. Frank publicó esta parte del método de análisis de imágenes a mediados de la década de 1980 y la utilizó para generar un modelo de la superficie de un ribosoma, la gigantesca maquinaria molecular que construye proteínas en el interior de la célula.

El método de procesamiento de imágenes de Joachim Frank fue fundamental para el desarrollo de cryo-EM.

 Daremos ahora un salto de unos años hacia atrás.

El método de Frank para obtener imágenes 3D

Dubochet obtuvo la primera imagen de un virus por vitrificación del agua en 1984.

Imagen de Nature 308: 32-36

Al tener que trabajar en vacío La vaporización del agua era un gran problema. Sin embargo, Jacques Dubochet vio una posible solución: enfriar el agua tan rápidamente que se solidificara para formar un vidrio en lugar de un cristal. Un vidrio parece un material sólido, pero en realidad es un fluido ya que sus moléculas están desordenadas. Dubochet se dio cuenta de que si pudiera obtener agua vitrificada, el haz de electrones se difractaría uniformemente y proporcionaría un fondo uniforme.

Inicialmente, el grupo de investigación intentó vitrificar pequeñas gotas de agua en nitrógeno líquido a -196 ° C, pero el éxito llegó cuando reemplazaron el nitrógeno por etano que, a su vez, se había enfriado con nitrógeno líquido. Bajo el microscopio vieron una gota que no se parecía a nada que hubieran visto antes. Primero supusieron que era etano, pero cuando la gota se calentó ligeramente, las moléculas se reorganizaron repentinamente y adquirieron la familiar estructura de un cristal de hielo. Fue un triunfo, ya que algunos investigadores sostenían que era imposible vitrificar las gotas de agua. Ahora creemos que el agua vitrificada es la forma más común de agua en el universo.

Después de los descubrimientos de 1982, el grupo de investigación de Dubochet desarrolló rápidamente la base de la técnica que todavía se usa en cryo-EM. Disolvieron sus muestras biológicas, inicialmente diferentes formas de virus, en agua. La solución se depositó luego en una fina malla metálica formando una película delgada. Usando un dispositivo similar a un arco, dispararon la red en el etano líquido para que la delgada película de agua se vitrificara.

En 1984, Jacques Dubochet publicó las primeras imágenes de varios virus diferentes, redondos y hexagonales, que se podían observar en marcado contraste con el fondo de agua vitrificada. El material biológico ahora podría prepararse con relativa facilidad para el microscopio electrónico, y los investigadores pronto llamaron a la puerta de Dubochet para aprender la nueva técnica.

Debido a que cryo-EM raramente podía visualizar otra cosa que no fuera una superficie desigual, el método a veces se llamaba "blobología" (término que quiere poner de manifiesto lo borroso (“blob”) de las imágenes obtenidas). Sin embargo, y en gran parte debido a que Richard Henderson mantuvo obstinadamente que el microscopio electrónico proporcionaría rutinariamente imágenes que mostrarían átomos individuales, se ha optimizado, poco a poco, cada tuerca y cada tornillo del microscopio electrónico logrando una mejora de la resolución hasta que el obstáculo técnico final se superó en 2013, cuando se puso en uso un nuevo tipo de detector de electrones.

Ahora el sueño es realidad y nos enfrentamos a un desarrollo explosivo de la bioquímica. Hay varias cosas que hacen que la cryo-EM sea tan revolucionaria: el método de vitrificación de Dubochet es relativamente fácil de usar y requiere un tamaño de muestra mínimo. Debido al rápido proceso de enfriamiento, las biomoléculas se pueden congelar de forma casi instantánea lo que permite tomar series de imágenes que capturan las diferentes partes de un proceso. De esta forma, producen 'películas' que revelan cómo las proteínas se mueven e interactúan con otras moléculas.